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作者Evil Genius今天我们分享文献一篇cell在手晋升几乎畅通无阻也说明了多组学是必然的趋势。摘要胰腺导管腺癌PDAC是一种侵袭性癌症预后不良其肿瘤微环境中包含肿瘤发生前就存在的组织驻留巨噬细胞RTMs和肿瘤发展过程中招募的单核细胞来源巨噬细胞MDMs但它们在支持肿瘤进展中的不同作用仍不清楚。结合单细胞profiling、空间分析、谱系追踪、RTM耗竭和硒示踪研究发现RTMs优先定位于肿瘤边界在那里它们促进上皮-间充质转化EMT、肿瘤生长和转移。机制上RTMs通过LRP8依赖性摄取将硒转运蛋白Selenop转移给EMT肿瘤细胞增加肿瘤细胞硒可用性限制脂质过氧化并保护EMT肿瘤细胞免于铁死亡。RTM特异性Selenop缺失或肿瘤细胞Lrp8破坏减少了EMT和肿瘤进展而铁死亡抑制逆转了RTM耗竭的效果。人类PDAC显示边界富集的SEPP1⁺RTMs靠近EMT肿瘤细胞提示一种保守的巨噬细胞来源的硒生态位支持侵袭性肿瘤状态并突出靶向RTMs或其分泌因子在PDAC中的潜力。引言PDAC的临床挑战PDAC占胰腺癌的90%以上仍然是最致命的实体瘤之一5年生存率低于13%。开发有效疗法的一个主要障碍是肿瘤微环境TME的独特组成这使PDAC肿瘤在宿主免疫和免疫治疗方面都是冷的因此免疫治疗对PDAC患者没有显示出显著获益。TME的重要性改善PDAC治疗需要更深入地理解TME特别是其免疫区室。PDAC TME包含致密基质、癌症相关成纤维细胞和多样免疫群体与癌细胞相互作用。其中肿瘤相关巨噬细胞TAMs调控CD8 T细胞排除、血管生成、纤维化和上皮-间充质转化EMT使其成为重要的治疗靶点。单细胞分析已解析跨肿瘤的巨噬细胞多样性。在PDAC中TAMs包括组织驻留巨噬细胞RTMs在肿瘤发生前存在以及单核细胞来源巨噬细胞MDMs在肿瘤进展过程中招募。区分巨噬细胞群体的挑战然而区分巨噬细胞群体、追踪其空间定位以及定义其在肿瘤中的功能仍然具有挑战性。先前的研究阐明了MDMs在代谢性脂肪性肝病和PDAC中的时空演化及重编程但RTMs的可比较分析受到缺乏追踪或耗竭工具的限制。最近的工作表明RTM发育起源影响胰腺疾病RTMs在PDAC中采用炎症状态但在胰腺炎中起保护作用。然而疾病信号如何与稳态线索交叉以在肿瘤进展过程中塑造RTM功能仍不清楚。研究目标研究团队旨在开发一种强大的工具来识别肿瘤内的RTMs并使用该工具在小鼠PDAC进展过程中剖析RTMs的作用。结合Ms4a3-based单核细胞命运映射、单细胞profiling和Mrc1CreERT2RosaTdTRosaDTR小鼠模型追踪、追踪和耗竭PDAC进展过程中的RTMs。结果揭示肿瘤边界RTMs分泌Selenop保护EMThi肿瘤细胞免于铁死亡并支持EMT。结果部分 1健康和胰腺癌中RTMs和MDMs的保守特征研究策略为了研究PDAC中RTMs和MDMs的功能特征首先需要在正常和肿瘤组织中可靠地区分它们。为此利用粒细胞-单核细胞祖细胞GMP命运映射Ms4a3CreRosaTdT小鼠其中MDMs用Tomato荧光标签标记而胚胎来源的RTMs则没有。对来自无肿瘤荷瘤小鼠健康胰腺的Tomato和Tomato-巨噬细胞的bulk RNA测序RNA-seq以及对Ms4a3CreRosaTdT小鼠胰腺肿瘤的scRNA-seq揭示不同的基因特征。MDMs和RTMs之间的差异表达基因DEGs包括在RTMs中高表达的Tfrc4和Cd209b以及在MDMs中富集的Spp1、Chil3、S100a8和Gdf3。RTM亚群鉴定使用这些DEGs识别PDAC中的RTMs通过重新分析最近发表的scRNA-seqsnRNA-seq鼠PDAC数据集来自时间戳小鼠模型Ms4a3CreERT2RosaTdT。基于Tomato标记、组织来源以及RTM和MDM签名基因的投影定义三个 distinct RTM亚群Folr2Lyve1RTM1Folr2、Lyve1、Mrc1和Selencop、Cd74H2RTM2Cd74、H2-Aa和IsgRTMIrf2和Isg15。由于这些数据集中IsgRTMs相对较少从进一步分析中排除。RTMs富集在健康胰腺的Tomato-巨噬细胞中表明RTM1代表真正的RTM亚群也可以被MDMs补充在TME中。正如预期从基因特征RTM1和RTM2可以通过流式细胞术基于其淋巴管内皮透明质酸受体1LYVE1表达识别。分选的群体富集不同的基因表达通路RTM1在胞吞作用和胞吐作用中富集RTM2在细胞激活中富集。还识别出四种巨噬细胞亚群表达高MDM签名三种TAM群体Clec4e中间TAMIntTAM、Spp1Bnip3TAM2和Spp1Cd36TAM3如先前报道以及一个富含健康胰腺的RetnlaEar2单核细胞来源的巨噬细胞样群体moMac。识别健康胰腺和肿瘤条件下RTMs和TAMs之间的DEGs。其中Mrc1编码CD206在RTMs中显著表达包括主要的RTM1s、RTM2s和IsgRTMs。流式细胞术免疫表型进一步确认胰腺组织中的Tomato-RTMs表达高水平的CD206、Tim4、Lyve1和CD209b。因此Mrc1可能是识别胰腺中所有RTM亚群的候选基因。结果部分 2植入前RTM耗竭限制PDAC进展并调节EMTRTM空间分布为了研究RTMs在PDAC中的作用首先使用Visium空间转录组数据分析其分布。从Ms4a3模型衍生的RTM签名的投影显示RTMs优先富集在肿瘤周围区域在植入后2周和6周。没有观察到RTM1和RTM2亚群之间的明显空间差异。类似的肿瘤边界周围富集已在鼠肺癌模型和人类原发性和转移性癌症中报道提示RTMs在肿瘤边界的保守空间定位模式和潜在特化功能。RTM耗竭模型由于Mrc1在稳态下由RTMs特异性表达使用Mrc1构建小鼠模型以在PDAC中 fate-map RTMs。开发Mrc1CreERT2小鼠品系并与RosaTdT小鼠杂交。他莫昔芬标记确认Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠在健康组织中追踪胰腺RTMs。接下来在PDAC原位注射前给予他莫昔芬治疗Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠并在PDAC生长过程中追踪Tomato-胰腺RTMs。Mrc1CreERT2模型本身不通过当前CD206表达识别RTMs。相反它依赖于他莫昔芬诱导的肿瘤前标记来永久标记肿瘤建立前表达CD206的巨噬细胞。在PDAC中的空间分析确认Tomato-RTMs富集在肿瘤边界而Tomato-CD68巨噬细胞浸润肿瘤核心与Visium数据一致。在相邻胰腺实质和肿瘤中观察到Tomato-巨噬细胞比例的逐渐减少可能由于招募的Tomato-MDMs稀释这与Ms4a3CreERT2RosaTdTPDAC模型中的观察一致。在Ms4a3CreERT2RosaTdT小鼠中CD206表达在Tomato-巨噬细胞MDMs上逐渐增加但在Tomato-Folr2RTMsMs4a3-上保持较低。类似的CD206巨噬细胞比例和分布的变化也在携带杂合KrasG12D和Trp53R172H改变的自发性PDAC模型LSL-KrasG12D; LSL-Trp53R172H; Pdx1Cre, KPC小鼠中观察到。RTM功能验证接下来通过生成Mrc1CreERT2RosaTdTRosaDTR小鼠品系来特异性耗竭RTMs以解决RTMs在肿瘤进展中的功能意义。他莫昔芬治疗后在肿瘤植入前给予白喉毒素DT。这在原位肿瘤植入前和初始疾病窗口耗竭RTMs的模型中建立。植入前RTM耗竭显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存。相比之下肿瘤植入后10天开始DT治疗对肿瘤生长或生存没有显著影响表明RTMs可能在初始阶段起关键作用此时RTMs相对于MDMs仍然突出。EMT调节RTMs在初始巨噬细胞定义窗口支持肿瘤进展的一种可能方式是通过促进肿瘤细胞侵袭和TME局部重塑如在鼠肺癌和胰腺癌模型中所示。首先检查RTM耗竭是否改变其他免疫细胞群体的组成但肿瘤植入后没有观察到显著变化。一致地scRNA-seq分析显示可比较的免疫细胞组成特别是Treg和Tex群体在植入前RTM耗竭组中。接下来评估肿瘤细胞增殖是否对RTM耗竭后的生长差异有贡献。植入前和植入后10天RTM耗竭都没有导致肿瘤细胞增殖显著增加与对照组相比表明增殖不是植入前RTM耗竭后观察到的肿瘤生长差异的原因。值得注意的是来自植入前RTM耗竭小鼠的肿瘤细胞显示E-钙粘蛋白表达增加这在10天RTM耗竭组中没有观察到。E-钙粘蛋白表达表明RTMs可能在这个窗口内影响上皮-间充质动力学。与这一假设一致小鼠PDAC Visium数据集显示RTMs优先定位于具有更高EMT签名的肿瘤区域。E-钙粘蛋白肿瘤细胞EMTlo的百分比在肿瘤边界200 μm内的植入前RTM耗竭组中显著增加而ZEB1肿瘤细胞EMThi的百分比在肿瘤边界降低。因为RTM耗竭也被报道在自发性胰腺肿瘤模型中抑制发育在独立的KPC模型中扩展分析。一致地RTM耗竭类似地降低了肿瘤边界处ZEB1肿瘤细胞EMThi的百分比与对照组相比。鉴于EMT在驱动肿瘤转移中的已建立作用进一步评估转移负担发现植入前RTM耗竭显著降低转移质量与对照相比。总之这些发现表明肿瘤边界的RTMs增强EMT并支持PDAC进展和转移播散。结果部分 3RTMs的进行性签名与肿瘤EMT负相关验证方法为了在更生理相关的PDAC模型中验证这些发现其中肿瘤细胞经历进行性发育并表现出异质性EMT状态分析了来自可诱导Ptf1aCre; LSL-KrasG12D; LSL-Trp53R270HPRT小鼠的公开scRNA-seq数据集跨越正常胰腺、癌前病变和胰腺癌。该数据集为概括自然肿瘤发生和EMT过程提供了稳健模型。此外利用来自自发性PDACPtf1aCre; LSL-KrasG12D; Trp53R172H或Trp53R270H模型的另一个well-annotated scRNA-seq数据集进一步注释这些上皮细胞。通过将上皮细胞聚类为15个亚群定义了一个新生群体子集包括胃样和祖细胞样癌前细胞和恶性细胞以进行进一步分析。EMT动态使用来自PRT模型的scRNA-seq数据分析了肿瘤进展不同时间点的上皮细胞。与EMT活动的动态变化一致早期时间点RTMs是主要的巨噬细胞群体但随着肿瘤发生RTMs的比例下降。与在整个肿瘤进展过程中RTMs中Mrc1表达逐渐降低一致。与MDMs相比RTM1s中代谢通路活动相对较高包括Mtr、Kyat1和Txndc3等通路相关基因。Selenop鉴定测量胰腺细胞中的Selenop蛋白水平进行细胞内染色和流式分析。该分析揭示Selenop蛋白水平在CD206RTMs中显著高于其他免疫和非免疫细胞。接下来评估肿瘤中Selenop蛋白的空间分布。Selenop蛋白水平在CK19hi肿瘤区域显著高于CK19lo区域后者位于RTM富集的肿瘤边界来自自发性模型和原位肿瘤模型。这一增加不是来自肿瘤中性粒细胞因为它们不显著表达Selenop。这些发现表明Selenop在早期RTM1s和EMTlo肿瘤细胞中大量表达并且其表达与上皮细胞的EMT活动负相关。鉴于这一独特特征以及RTMs共定位于相同的肿瘤周围区域EMT发生的地方以及Selenop在调节活性氧ROS水平中的作用假设RTM衍生的Selenop可能潜在参与EMT调节。结果部分 4RTMs通过Selenop促进肿瘤细胞EMTSelenop功能验证为了研究RTM衍生的Selenop对肿瘤EMT的影响将Selenopfl/fl小鼠与Mrc1CreERT2小鼠杂交以条件性敲除Selenop基因在RTMs中。野生型WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠在原位肿瘤细胞注射前用他莫昔芬治疗。Selenop蛋白在CD206RTMs中显著减少但没有诱导绝对细胞数、增殖、凋亡或健康胰腺中已知促肿瘤分子的清除的显著变化Selenop蛋白水平在胰腺组织中显著降低但在血浆中相当支持在RTM中Selenop的整体旁分泌效应而非系统循环Selenop。Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠在肿瘤植入后具有更小的肿瘤尺寸和更好的生存与Selenopfl/flWT对照相比。重要的是来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞显示E-钙粘蛋白表达增加和EMT签名降低特别是在RTM富集的肿瘤边界区域但没有减少增殖。此外Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠显示显著降低的转移潜力与WT肿瘤相比。这些结果支持RTM衍生Selenop在促进肿瘤进展和肿瘤细胞EMT中的重要性。LRP8介导的摄取低密度脂蛋白受体相关蛋白8LRP8是一种可以介导细胞外Selenop摄取的受体。为了探究LRP8介导的Selenop摄取是否与RTM衍生Selenop模型一致生成Lrp8缺陷肿瘤细胞可以在体外正常增殖。WT小鼠注射Lrp8缺陷肿瘤细胞显示显著更小的肿瘤尺寸和降低的肿瘤EMT与对照组相比。进一步评估WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠中对照和Lrp8缺陷肿瘤细胞的肿瘤生长。来自其他三组的肿瘤显著小于来自WT小鼠的对照肿瘤。在Lrp8缺陷肿瘤组中WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠之间的肿瘤生长差异被消除。这些结果暗示LRP8可能介导RTM衍生Selenop向肿瘤细胞的转移并促进肿瘤EMT。体内硒转移为了检查Selenop转移是否在体内从RTMs转移到肿瘤细胞用74Se同位素在生理剂量下治疗对照、植入前RTM耗竭和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl荷瘤小鼠在肿瘤植入后28天。使用同位素作为示踪剂74Se水平在来自植入前RTM耗竭和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞中显著降低与对照小鼠相比。在RTM富集的肿瘤边界也观察到74Se密度的显著下降支持肿瘤细胞中的硒含量由RTM衍生Selenop在体内调节的结论。共培养验证建立共培养系统使用肿瘤细胞和巨噬细胞。用Na274SeO3处理巨噬细胞并在充分洗涤后与肿瘤细胞共培养后肿瘤细胞中的74Se信号显著高于与肿瘤细胞共培养前的基线水平但与Selenop缺陷巨噬细胞共培养时降低。支持肿瘤细胞中巨噬细胞衍生Selenop的结论。与Lrp8-/-肿瘤细胞共培养时分离的Lrp8-/-肿瘤细胞中的74^Se信号较低。结果部分 5RTMs通过Selenop保护肿瘤细胞免于铁死亡铁死亡保护脂质ROS水平在来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞中显著高于WT组。脂质过氧化标记物4-羟基壬烯醛4HNE水平在肿瘤边界显著增加。还测量了来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠肿瘤边界中4HNE肿瘤细胞与CD206巨噬细胞之间的距离减少与WT小鼠相比表明RTM衍生Selenop可能保护肿瘤细胞免于肿瘤边界处的铁死亡。铁死亡签名在来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤边界区域显著上调与WT小鼠相比表明在缺乏RTM衍生Selenop的情况下肿瘤边界处铁死亡增加。为了直接评估巨噬细胞衍生Selenop是否可以保护肿瘤细胞免于铁死亡将肿瘤细胞与Selenop充足或Selenop缺陷的腹腔巨噬细胞共培养并用铁死亡诱导剂RSL3处理。E-钙粘蛋白肿瘤细胞与Selenop充足巨噬细胞共培养显示显著降低的脂质过氧化与Selenop缺陷巨噬细胞相比。这些结果表明巨噬细胞衍生Selenop可以在体外直接拯救间充质肿瘤细胞免于铁死亡。增加的脂质过氧化也在植入前RTM耗竭组的肿瘤边界中观察到与对照组相比。铁死亡抑制剂liproxstatin-1治疗显著逆转了植入前RTM耗竭的抗肿瘤效果。在自发性胰腺肿瘤伴巨噬细胞耗竭中也观察到类似结果。总之这些发现表明RTMs通过在肿瘤边界提供外源性Selenop保护间充质肿瘤细胞免于铁死亡从而促进肿瘤EMT和向正常组织的侵袭性。结果部分 6RTM衍生SEPP1与人类患者中EMT介导的肿瘤进展相关人类PDAC验证基于在鼠PDAC中的发现研究人类RTM衍生SELENOP也称为SEPP1是否以类似方式影响患者肿瘤细胞EMT。在人类PDAC中观察到从相邻胰腺到肿瘤的空间硒水平和SEPP1密度显著降低。在肿瘤内SEPP1表达在E-钙粘蛋白lo区域高于E-钙粘蛋白hi区域。肿瘤细胞的4HNE MFI在肿瘤核心显著高于肿瘤边界。此外CD206表达在肿瘤边界显著高于匹配的肿瘤核心区域。肿瘤边界CD206表达较高的患者预后更差。这种模式也在公共PDAC数据库中观察到。这些观察表明鼠和人类PDAC中保守的RTM和SEPP1模式。人类RTM群体为了进一步研究人类PDAC中的RTM群体及其空间定位收集了额外的PDAC患者scRNA-seq数据识别出六个 distinct 单核细胞簇。与小鼠结果和其他人类PDAC数据集一致识别出FOLR2RTMs其高表达SLC40A1/SEPP1。使用Xenium多组织和癌症面板377个基因的空间转录组 profiling 进一步确认RTMs富集在肿瘤边界。scMetabolism和基因集变异分析GSVA揭示FOLR2RTMs表现出最高的硒化合物代谢活性和与硒结合和硒微量营养素网络相关的上调通路。由于SEPP1未包含在Xenium基因面板中使用基于测序的Stereo-seq获得全转录组数据验证FOLR2RTM标记基因包括FOLR2、SEPP1、CD209和SLC40A1在肿瘤边界共表达。这些发现表明FOLR2RTMs存在于人类PDAC的肿瘤边界并显示SEPP1的高表达水平以及增加的硒代谢活性。EMT与SEPP1相关性计算scRNA-seq数据中所有恶性细胞的EMT评分将其分为三组EMThi、EMTmed和EMTlo。与小鼠数据一致人类PDAC细胞中SEPP1表达与EMT和铁死亡通路活性负相关也在其他肿瘤类型中。代谢通量分析揭示硒酸盐和硒代蛋氨酸的摄取能力在间充质恶性细胞中显著降低。这意味着人类间充质PDAC细胞可能依赖外部SEPP1作为对抗铁死亡的拯救机制。使用稳健细胞类型分解RCTD估计Stereo-seq数据中每种细胞类型的比例发现FOLR2RTMs在空间上更接近EMThi细胞而非EMTmed和EMTlo PDAC细胞。总之数据表明在人类PDAC中RTMs可能通过在肿瘤边界提供SEPP1保护间充质肿瘤细胞免于铁死亡。讨论核心发现本研究定义了胰腺癌中RTMs的起源、异质性和功能。使用谱系追踪识别出健康和PDAC中保守的RTM签名并聚焦于植入前时间窗口此时RTMs在MDMs成为数量主导之前仍然突出。在这个窗口期RTM耗竭减缓PDAC进展支持在肿瘤侵袭和EMT相关进展中的作用而非在从良性到恶性疾病的遗传转变中。空间转录组学显示RTMs在肿瘤外周积累RTM衍生Selenop保护肿瘤细胞免于铁死亡并支持EMT。总之这些发现支持一个模型其中RTM衍生Selenop向间充质肿瘤细胞提供外源性硒限制铁死亡并促进侵袭。巨噬细胞功能起源 distinct 的巨噬细胞在肿瘤中发挥阶段和空间限制的功能。在肺和胰腺腺癌中RTMs贡献于肿瘤相关生态位而肺泡巨噬细胞促进EMT、调节性T细胞激活和组织重塑在非小细胞肺癌中。RTMs通常重新分布到肿瘤外周并在肿瘤核心逐渐被MDMs替代。跨癌症浸润的MDMs经常获得触发受体在髓系细胞上表达2TREM2程序也在慢性炎症和阿尔茨海默病中看到并且在PDAC中描述了空间 distinct 的MDM亚群。相比之下RTMs保留与组织发育和伤口修复相关的功能可能被肿瘤劫持以通过Selenop分泌支持EMT。EMT可以促进适应性肿瘤状态的出现数据揭示上皮Selenop表达与EMT活动之间的反向关系表明EMT相关程序可能抑制Selenop表达。RTM衍生Selenop也可能呼应发育程序因为RTMs和硒在胚胎发生中都是必需的。这种现象类似于非恶性细胞中的癌胎重编程其中胎儿样程序在TME中重新出现。研究发现表明胎儿样RTMs可能不仅塑造免疫抑制微环境还通过分泌必需分子直接支持肿瘤存活。因此肿瘤可能劫持发育和修复相关的巨噬细胞程序以创建营养支持生态位维持侵袭性癌症状态。EMT与铁死亡的联系EMT和铁死亡通过细胞可塑性、脂质重塑和氧化还原控制相联系。在EMT过程中E-钙粘蛋白丢失和EMT驱动因子如ZEB1可以激活YAP-ACSL4信号重塑磷脂并使膜富含易过氧化的脂质而GPX4中心的防御、胱氨酸代谢和脂质去饱和通路缓冲氧化应激。因此EMT促进侵袭和适应同时创造对铁死亡的条件性脆弱性其结果取决于脂质过氧化物解毒是否保持完整。研究识别出Selenop作为外部巨噬细胞衍生因子缓冲这种脆弱性。RTM衍生Selenop不是边界相关EMT的唯一驱动因素因为当Selenop减少时EMT特征持续存在并且可能由炎症线索、缺氧、细胞外基质重塑和肿瘤内在EMT程序维持。尽管如此靶向RTMs或Selenop可能在时间定义的TME背景下暴露EMThigh肿瘤细胞于铁死亡。总结研究识别出RTMs作为PDAC中的促肿瘤巨噬细胞谱系RTM衍生Selenop作为EMT相关铁死亡抵抗的关键介质。更广泛地说TME中的细胞外支持不仅由 bulk 营养可用性塑造还由细胞状态特异性依赖和生态位定义的免疫回路塑造。局限性模型限制原位模型发展迅速不是研究EMT全时间谱的理想模型。因此早期或初始指的是微环境定义的窗口而非癌前PDAC的最早遗传步骤。由于p53突变在PDAC患者中通常是晚期事件在没有Trp53扰动的自发性模型中的验证将很重要。Mrc1靶向的脱靶效应尽管Mrc1CreERT2RosaTdT没有标记胰腺内皮细胞但Mrc1驱动的靶向的胰腺外效应仍然是注意事项。膳食硒的作用RTM-Selenop轴中膳食硒的作用仍未解决。系统性硒耗竭难以测试因为硒具有狭窄的缺乏-毒性窗口长期耗竭可能引入系统性混杂因素。SEPP1的临床意义SEPP1的临床意义仍未解决因为肿瘤边界SEPP1可能反映混合细胞来源和具有非等价生物效应的不同亚型尽管SEPP1表达在多种肿瘤类型中与EMT负相关。其他硒蛋白的冗余尽管其他硒蛋白在转录水平上没有稳健诱导但不能排除蛋白质或活性水平的冗余。未来研究将需要更严格地控制系统性硒状态和更高的空间、亚型特异性和功能分辨率。方法小鼠小鼠在SPF条件下饲养于上海交通大学医学院动物设施。所有涉及动物的程序由上海交通大学医学院机构动物护理和使用委员会IACUC审查和批准。除非另有说明体内实验使用年龄和性别匹配的C57BL/6背景小鼠。Ms4a3Cre和Ms4a3CreERT2小鼠由研究团队生成并先前描述。Mrc1CreERT2小鼠在上海模式生物中心生成。Selenopflox小鼠从Cyagen购买。Selenopflox小鼠和Lyz2Cre小鼠杂交生成Lyz2CreSelenopflox小鼠。细胞系鼠源KPC1199细胞系源自自发性PDAC小鼠模型KPCLSL-KrasG12D/; Trp53R172H/, Pdx1Cre在C57BL/6遗传背景。荧光素酶稳定的胰腺导管腺癌FC1242L细胞系源自LSL-KrasG12D; LSL-Trp53/R172H; Pdx1CreKPC小鼠。FC1242L细胞系用于原位肿瘤注射。KPC1199细胞系用于体外细胞共培养。人类临床样本获取人类PDAC标本和相关临床数据从上海交通大学医学院瑞金医院获得经瑞金医院伦理委员会批准。敲除细胞系生成对于CRISPR-Cas9敲除细胞系合成靶向小鼠Zeb1、小鼠Selenop和小鼠Lrp8的sgRNAs并克隆到GV708载体中。构建体用Lipofectamine 3000引入肿瘤细胞成功转染的细胞通过嘌呤霉素选择富集。通过有限稀释获得克隆系。通过Sanger测序和流式细胞术评估蛋白质表达验证基因破坏。小鼠治疗和RTM耗竭对于谱系标记Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠通过口服灌胃接受他莫昔芬连续四天每剂含1.75 mg在100 μL中最终剂量在肿瘤注射前三天。为了耗竭RTMsMrc1CreERT2RosaDTR小鼠如上接受他莫昔芬然后在肿瘤注射前两天或后10天通过腹腔注射接受500 ng白喉毒素在200 μL PBS中。Liproxstatin-1通过腹腔注射以10 mg/kg给药从肿瘤植入后第10天开始每周两次直至收获。对于KPC小鼠中的RTM耗竭6周龄动物在第1天静脉接受1 mg抗小鼠CSF1抗体随后在第2天腹腔接受200 μL氯膦酸盐脂质体。肿瘤细胞原位注射对于原位植入2.5×105肿瘤细胞制备在50 μL含30% Matrigel的冰冷PBS中在麻醉下注射到胰腺。体内生物发光发射成像荧光素酶稳定肿瘤细胞植入以进行肿瘤生长的纵向监测。在注射后第7、14、21和28天小鼠用异氟烷麻醉并在腹腔注射D-荧光素150 mg/kg8分钟后使用IVIS Spectrum系统成像。细胞分离胰腺切成小块并用0.2 mg/mL IV型胶原酶和0.05 mg/mL DNase I在含10% FBS的RPMI 1640中37°C消化30分钟。消化后组织悬液通过反复通过1.2 mm内径针头机械分散。匀浆细胞通过70 μm孔径细胞筛过滤并用MACS缓冲液洗涤两次。红细胞在ACK缓冲液中裂解三分钟。流式细胞术和细胞分选从胰腺或肿瘤组织生成的单细胞悬液进行流式细胞术染色和分析。样品在Cytek Aurora光谱流式细胞仪上运行所得FCS文件在FlowJo中分析。荧光标记群体在BD FACSAria III上纯化DAPI用于排除非活力细胞。免疫荧光和分析新鲜收集的组织在1%多聚甲醛PFA中浸泡过夜固定随后在30%蔗糖中冷冻保护。样品嵌入OCT化合物并使用Leica冷冻切片机切片为20 μm。荧光图像使用SLIDEVIEW VS200载玻片扫描仪或FLUOVIEW FV3000共聚焦显微镜获取。多重免疫组化mIHC组织收获并在4% PFA中固定过夜梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋。mIHC测定在5 μm厚切片上使用Tyramide Signal AmplificationTSA七色试剂盒按照制造商说明进行。图像使用SLIDEVIEW VS200捕获使用QuPathv.0.6.0分析。循环多重TSACmTSA组织收获并在4% PFA中固定过夜梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋。FFPE组织样品切成5 μm厚切片并在二甲苯中脱蜡通过梯度乙醇再水化并使用柠檬酸盐缓冲液pH 6.0在95°C下热诱导抗原修复30分钟。抗体标记使用IRISKit HyperView mTSA Kit进行。图像配准使用Fiji实现。mIHC分析mIHC图像的数字化定量使用QuPath进行。原始数据预处理用于背景减除和通道对齐。细胞分割使用QuPath-Cellpose扩展执行利用cpsamCellpose-SAM预训练模型基于DAPI核和膜/细胞质标记物稳健识别细胞边界。细胞通过基于个体标记物强度阈值的分层布尔逻辑进行表型分型。对于空间表征手动注释肿瘤边界以定义两个200 μm小鼠或500 μm人类区域肿瘤内和肿瘤周围。IHC定量H-score对于人类PDAC IHC染色全切片图像使用QuPath分析。组织区域基于形态学特征分类为肿瘤和相邻胰腺。H-score使用内置阳性细胞检测命令计算。细胞间距离定量为了量化4HNE和CD206细胞之间的空间关联首先从数字化图像中提取其质心坐标。对于每个4HNE细胞通过使用K-最近邻KNN算法k1计算欧几里得距离确定其最近CD206邻居的邻近性。体外细胞共培养1×105胰腺肿瘤细胞和4×104来自Lyz2CreSelenopfl/fl或野生型小鼠的腹腔巨噬细胞在48孔板中共培养3天在含5 nM RSL3的培养基中。用BODIPY 581/591 C11染色后通过流式细胞术检测肿瘤细胞的脂质ROS水平。Na274SeO3合成1.6 mg 74Se粉末溶解在20 μL 70% HNO3中加入180 μL去离子水制成108.2 mmol/L H274SeO3溶液。使用10 M NaOH溶液将pH调节至10.5通过加入去离子水将体积增加至800 μL使74Se浓度为27.1 mmol/L。储备液储存在4°C。体外74Se转移测定小鼠腹腔注射450 μg/kg Na274SeO3。三天后收集腹腔巨噬细胞彻底洗涤以5×105细胞/孔接种在6孔板中然后与肿瘤细胞共培养36小时。CD45CD11bF4/80巨噬细胞和CD45-肿瘤细胞通过FACS分选通过电感耦合等离子体质谱ICP-MS测量74Se含量。体内74Se转移测定在原位肿瘤植入后第28天小鼠接受单次腹腔注射90 μg/kg Na274SeO3。三天后通过FACS分选肿瘤细胞并通过ICP-MS测量74Se含量。电感耦合等离子体质谱通过FACS分离细胞群体彻底洗涤细胞然后用100 μL双蒸水裂解。将100 μL细胞裂解物的准确体积转移到反应离心管中加入100 μL硝酸68%。混合物在水浴中100°C加热一小时然后冷却并用双蒸水稀释至最终体积1 mL。使用PerkinElmer ICP-MS测量细胞中74Se浓度。激光烧蚀电感耦合等离子体质谱LA-ICP-MS小鼠和人类肿瘤组织石蜡包埋切成10 μm厚切片脱蜡。使用GenesisBIO飞秒激光烧蚀系统和四极杆ICP-MS仪器分析每个组织切片感兴趣区域ROIs中硒Se的分布。小鼠中74Se硒分布和人类肿瘤切片中80硒分布通过LA-ICP-MS分析。测量元素强度谱转换为2D图并使用Iolite V4进一步处理。单细胞RNA测序肿瘤组织在含10% FBS的RPMI-1640中切成1-2 mm3小块。这些小块使用肿瘤解离试剂盒在gentleMACS Octo Dissociator中37°C消化一小时严格按照制造商说明。解离细胞通过70 μm孔径SmartStrainer过滤并在冰上用红细胞裂解溶液处理5-10分钟以去除红细胞。细胞用PBS洗涤两次并以300×g离心五分钟。临床PDAC样品的空间转录组学Xenium In Situ空间转录组 profiling为了评估FFPE块内的组织质量进行HE和DAPI染色。组织样品还通过测量DV200确定RNA完整性。FFPE切片使用制造商推荐的FFPE方案处理用于Xenium In Situ分析。Stereo-seq样品制备和处理新鲜组织在切除后30分钟内用无菌无纺布干燥并嵌入OCT。冷冻切片使用LEICA CM1950冷冻切片机在-20°C切成10 μm厚度。数据分析Bulk RNA-seq数据分析Bulk RNA-seq数据在TPM水平定量随后使用preprocessCore R包进行分位数归一化。使用ComBat校正不同组织之间的批次效应。scRNA-seq数据分析来自Ms4a3CreERT2RosaTdT的scRNA-seq数据首先按组织来源分层随后与来自可诱导自发性KC小鼠的scRNA-seq数据进行典型相关分析-based整合。聚类使用top 15主成分PCs和0.6的分辨率进行。基因集富集分析使用LIMMA包计算基因表达差异调整P值0.05的基因定义为DEGs。GO通路富集在R中使用clusterProfiler的gseGO函数进行。基因集变异分析使用GSVA包实现。差异丰度分析使用观察与预期细胞数比率Ro/e测试治疗组之间细胞丰度差异。代谢分析scMetabolism用于在单细胞分辨率量化小鼠和人类巨噬细胞的代谢活动。使用METAFlux计算人类PDAC TME中硒酸盐和硒代蛋氨酸的通量。空间转录组学数据分析10x Visium数据使用Seurat R包分析使用SCTransform进行数据归一化和特征选择。Xenium数据使用LoadXenium加载后过滤少于15个计数和十个基因的细胞。Stereo-seq分析中表达矩阵分箱为非重叠100×100或10×10 DNB窗口。生存分析PDAC患者的总生存OS分析使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行。统计统计分析使用GraphPad Prism 10进行除非另有说明。数据表示为平均值±SD除非另有说明。对于两组比较正态分布数据集使用双尾非配对Students t检验分析而非参数数据集使用Mann-Whitney U检验评估。配对数据使用配对t检验分析。分类变量使用Fisher精确检验分析。生存曲线使用Kaplan-Meier方法生成并通过log-rank检验比较。统计显著性定义为p0.05p0.01**p0.001****p0.0001ns不显著p0.05。关键结论RTMs在肿瘤边界富集RTMs优先定位于PDAC肿瘤边界在那里它们促进EMT、肿瘤生长和转移。Selenop作为关键介质RTMs通过LRP8依赖性摄取将硒转运蛋白Selenop转移给EMT肿瘤细胞增加肿瘤细胞硒可用性限制脂质过氧化并保护EMT肿瘤细胞免于铁死亡。遗传验证RTM特异性Selenop缺失或肿瘤细胞Lrp8破坏减少了EMT和肿瘤进展而铁死亡抑制逆转了RTM耗竭的效果。人类PDAC保守性人类PDAC显示边界富集的SEPP1⁺RTMsFOLR2⁺靠近EMT肿瘤细胞提示一种保守的巨噬细胞来源的硒生态位支持侵袭性肿瘤状态。治疗意义靶向RTMs或其分泌因子如Selenop可能代表PDAC治疗的新策略通过暴露EMThigh肿瘤细胞于铁死亡。概念性贡献TME中的细胞外支持不仅由 bulk 营养可用性塑造还由细胞状态特异性依赖和生态位定义的免疫回路塑造。肿瘤可能劫持发育和修复相关的巨噬细胞程序以创建营养支持生态位维持侵袭性癌症状态。生活很好有你更好。 文献分享（xenium）--组织驻留巨噬细胞转移硒转运蛋白保护胰腺癌免于铁死亡
作者Evil Genius今天我们分享文献一篇cell在手晋升几乎畅通无阻也说明了多组学是必然的趋势。摘要胰腺导管腺癌PDAC是一种侵袭性癌症预后不良其肿瘤微环境中包含肿瘤发生前就存在的组织驻留巨噬细胞RTMs和肿瘤发展过程中招募的单核细胞来源巨噬细胞MDMs但它们在支持肿瘤进展中的不同作用仍不清楚。结合单细胞profiling、空间分析、谱系追踪、RTM耗竭和硒示踪研究发现RTMs优先定位于肿瘤边界在那里它们促进上皮-间充质转化EMT、肿瘤生长和转移。机制上RTMs通过LRP8依赖性摄取将硒转运蛋白Selenop转移给EMT肿瘤细胞增加肿瘤细胞硒可用性限制脂质过氧化并保护EMT肿瘤细胞免于铁死亡。RTM特异性Selenop缺失或肿瘤细胞Lrp8破坏减少了EMT和肿瘤进展而铁死亡抑制逆转了RTM耗竭的效果。人类PDAC显示边界富集的SEPP1⁺RTMs靠近EMT肿瘤细胞提示一种保守的巨噬细胞来源的硒生态位支持侵袭性肿瘤状态并突出靶向RTMs或其分泌因子在PDAC中的潜力。引言PDAC的临床挑战PDAC占胰腺癌的90%以上仍然是最致命的实体瘤之一5年生存率低于13%。开发有效疗法的一个主要障碍是肿瘤微环境TME的独特组成这使PDAC肿瘤在宿主免疫和免疫治疗方面都是冷的因此免疫治疗对PDAC患者没有显示出显著获益。TME的重要性改善PDAC治疗需要更深入地理解TME特别是其免疫区室。PDAC TME包含致密基质、癌症相关成纤维细胞和多样免疫群体与癌细胞相互作用。其中肿瘤相关巨噬细胞TAMs调控CD8 T细胞排除、血管生成、纤维化和上皮-间充质转化EMT使其成为重要的治疗靶点。单细胞分析已解析跨肿瘤的巨噬细胞多样性。在PDAC中TAMs包括组织驻留巨噬细胞RTMs在肿瘤发生前存在以及单核细胞来源巨噬细胞MDMs在肿瘤进展过程中招募。区分巨噬细胞群体的挑战然而区分巨噬细胞群体、追踪其空间定位以及定义其在肿瘤中的功能仍然具有挑战性。先前的研究阐明了MDMs在代谢性脂肪性肝病和PDAC中的时空演化及重编程但RTMs的可比较分析受到缺乏追踪或耗竭工具的限制。最近的工作表明RTM发育起源影响胰腺疾病RTMs在PDAC中采用炎症状态但在胰腺炎中起保护作用。然而疾病信号如何与稳态线索交叉以在肿瘤进展过程中塑造RTM功能仍不清楚。研究目标研究团队旨在开发一种强大的工具来识别肿瘤内的RTMs并使用该工具在小鼠PDAC进展过程中剖析RTMs的作用。结合Ms4a3-based单核细胞命运映射、单细胞profiling和Mrc1CreERT2RosaTdTRosaDTR小鼠模型追踪、追踪和耗竭PDAC进展过程中的RTMs。结果揭示肿瘤边界RTMs分泌Selenop保护EMThi肿瘤细胞免于铁死亡并支持EMT。结果部分 1健康和胰腺癌中RTMs和MDMs的保守特征研究策略为了研究PDAC中RTMs和MDMs的功能特征首先需要在正常和肿瘤组织中可靠地区分它们。为此利用粒细胞-单核细胞祖细胞GMP命运映射Ms4a3CreRosaTdT小鼠其中MDMs用Tomato荧光标签标记而胚胎来源的RTMs则没有。对来自无肿瘤荷瘤小鼠健康胰腺的Tomato和Tomato-巨噬细胞的bulk RNA测序RNA-seq以及对Ms4a3CreRosaTdT小鼠胰腺肿瘤的scRNA-seq揭示不同的基因特征。MDMs和RTMs之间的差异表达基因DEGs包括在RTMs中高表达的Tfrc4和Cd209b以及在MDMs中富集的Spp1、Chil3、S100a8和Gdf3。RTM亚群鉴定使用这些DEGs识别PDAC中的RTMs通过重新分析最近发表的scRNA-seqsnRNA-seq鼠PDAC数据集来自时间戳小鼠模型Ms4a3CreERT2RosaTdT。基于Tomato标记、组织来源以及RTM和MDM签名基因的投影定义三个 distinct RTM亚群Folr2Lyve1RTM1Folr2、Lyve1、Mrc1和Selencop、Cd74H2RTM2Cd74、H2-Aa和IsgRTMIrf2和Isg15。由于这些数据集中IsgRTMs相对较少从进一步分析中排除。RTMs富集在健康胰腺的Tomato-巨噬细胞中表明RTM1代表真正的RTM亚群也可以被MDMs补充在TME中。正如预期从基因特征RTM1和RTM2可以通过流式细胞术基于其淋巴管内皮透明质酸受体1LYVE1表达识别。分选的群体富集不同的基因表达通路RTM1在胞吞作用和胞吐作用中富集RTM2在细胞激活中富集。还识别出四种巨噬细胞亚群表达高MDM签名三种TAM群体Clec4e中间TAMIntTAM、Spp1Bnip3TAM2和Spp1Cd36TAM3如先前报道以及一个富含健康胰腺的RetnlaEar2单核细胞来源的巨噬细胞样群体moMac。识别健康胰腺和肿瘤条件下RTMs和TAMs之间的DEGs。其中Mrc1编码CD206在RTMs中显著表达包括主要的RTM1s、RTM2s和IsgRTMs。流式细胞术免疫表型进一步确认胰腺组织中的Tomato-RTMs表达高水平的CD206、Tim4、Lyve1和CD209b。因此Mrc1可能是识别胰腺中所有RTM亚群的候选基因。结果部分 2植入前RTM耗竭限制PDAC进展并调节EMTRTM空间分布为了研究RTMs在PDAC中的作用首先使用Visium空间转录组数据分析其分布。从Ms4a3模型衍生的RTM签名的投影显示RTMs优先富集在肿瘤周围区域在植入后2周和6周。没有观察到RTM1和RTM2亚群之间的明显空间差异。类似的肿瘤边界周围富集已在鼠肺癌模型和人类原发性和转移性癌症中报道提示RTMs在肿瘤边界的保守空间定位模式和潜在特化功能。RTM耗竭模型由于Mrc1在稳态下由RTMs特异性表达使用Mrc1构建小鼠模型以在PDAC中 fate-map RTMs。开发Mrc1CreERT2小鼠品系并与RosaTdT小鼠杂交。他莫昔芬标记确认Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠在健康组织中追踪胰腺RTMs。接下来在PDAC原位注射前给予他莫昔芬治疗Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠并在PDAC生长过程中追踪Tomato-胰腺RTMs。Mrc1CreERT2模型本身不通过当前CD206表达识别RTMs。相反它依赖于他莫昔芬诱导的肿瘤前标记来永久标记肿瘤建立前表达CD206的巨噬细胞。在PDAC中的空间分析确认Tomato-RTMs富集在肿瘤边界而Tomato-CD68巨噬细胞浸润肿瘤核心与Visium数据一致。在相邻胰腺实质和肿瘤中观察到Tomato-巨噬细胞比例的逐渐减少可能由于招募的Tomato-MDMs稀释这与Ms4a3CreERT2RosaTdTPDAC模型中的观察一致。在Ms4a3CreERT2RosaTdT小鼠中CD206表达在Tomato-巨噬细胞MDMs上逐渐增加但在Tomato-Folr2RTMsMs4a3-上保持较低。类似的CD206巨噬细胞比例和分布的变化也在携带杂合KrasG12D和Trp53R172H改变的自发性PDAC模型LSL-KrasG12D; LSL-Trp53R172H; Pdx1Cre, KPC小鼠中观察到。RTM功能验证接下来通过生成Mrc1CreERT2RosaTdTRosaDTR小鼠品系来特异性耗竭RTMs以解决RTMs在肿瘤进展中的功能意义。他莫昔芬治疗后在肿瘤植入前给予白喉毒素DT。这在原位肿瘤植入前和初始疾病窗口耗竭RTMs的模型中建立。植入前RTM耗竭显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存。相比之下肿瘤植入后10天开始DT治疗对肿瘤生长或生存没有显著影响表明RTMs可能在初始阶段起关键作用此时RTMs相对于MDMs仍然突出。EMT调节RTMs在初始巨噬细胞定义窗口支持肿瘤进展的一种可能方式是通过促进肿瘤细胞侵袭和TME局部重塑如在鼠肺癌和胰腺癌模型中所示。首先检查RTM耗竭是否改变其他免疫细胞群体的组成但肿瘤植入后没有观察到显著变化。一致地scRNA-seq分析显示可比较的免疫细胞组成特别是Treg和Tex群体在植入前RTM耗竭组中。接下来评估肿瘤细胞增殖是否对RTM耗竭后的生长差异有贡献。植入前和植入后10天RTM耗竭都没有导致肿瘤细胞增殖显著增加与对照组相比表明增殖不是植入前RTM耗竭后观察到的肿瘤生长差异的原因。值得注意的是来自植入前RTM耗竭小鼠的肿瘤细胞显示E-钙粘蛋白表达增加这在10天RTM耗竭组中没有观察到。E-钙粘蛋白表达表明RTMs可能在这个窗口内影响上皮-间充质动力学。与这一假设一致小鼠PDAC Visium数据集显示RTMs优先定位于具有更高EMT签名的肿瘤区域。E-钙粘蛋白肿瘤细胞EMTlo的百分比在肿瘤边界200 μm内的植入前RTM耗竭组中显著增加而ZEB1肿瘤细胞EMThi的百分比在肿瘤边界降低。因为RTM耗竭也被报道在自发性胰腺肿瘤模型中抑制发育在独立的KPC模型中扩展分析。一致地RTM耗竭类似地降低了肿瘤边界处ZEB1肿瘤细胞EMThi的百分比与对照组相比。鉴于EMT在驱动肿瘤转移中的已建立作用进一步评估转移负担发现植入前RTM耗竭显著降低转移质量与对照相比。总之这些发现表明肿瘤边界的RTMs增强EMT并支持PDAC进展和转移播散。结果部分 3RTMs的进行性签名与肿瘤EMT负相关验证方法为了在更生理相关的PDAC模型中验证这些发现其中肿瘤细胞经历进行性发育并表现出异质性EMT状态分析了来自可诱导Ptf1aCre; LSL-KrasG12D; LSL-Trp53R270HPRT小鼠的公开scRNA-seq数据集跨越正常胰腺、癌前病变和胰腺癌。该数据集为概括自然肿瘤发生和EMT过程提供了稳健模型。此外利用来自自发性PDACPtf1aCre; LSL-KrasG12D; Trp53R172H或Trp53R270H模型的另一个well-annotated scRNA-seq数据集进一步注释这些上皮细胞。通过将上皮细胞聚类为15个亚群定义了一个新生群体子集包括胃样和祖细胞样癌前细胞和恶性细胞以进行进一步分析。EMT动态使用来自PRT模型的scRNA-seq数据分析了肿瘤进展不同时间点的上皮细胞。与EMT活动的动态变化一致早期时间点RTMs是主要的巨噬细胞群体但随着肿瘤发生RTMs的比例下降。与在整个肿瘤进展过程中RTMs中Mrc1表达逐渐降低一致。与MDMs相比RTM1s中代谢通路活动相对较高包括Mtr、Kyat1和Txndc3等通路相关基因。Selenop鉴定测量胰腺细胞中的Selenop蛋白水平进行细胞内染色和流式分析。该分析揭示Selenop蛋白水平在CD206RTMs中显著高于其他免疫和非免疫细胞。接下来评估肿瘤中Selenop蛋白的空间分布。Selenop蛋白水平在CK19hi肿瘤区域显著高于CK19lo区域后者位于RTM富集的肿瘤边界来自自发性模型和原位肿瘤模型。这一增加不是来自肿瘤中性粒细胞因为它们不显著表达Selenop。这些发现表明Selenop在早期RTM1s和EMTlo肿瘤细胞中大量表达并且其表达与上皮细胞的EMT活动负相关。鉴于这一独特特征以及RTMs共定位于相同的肿瘤周围区域EMT发生的地方以及Selenop在调节活性氧ROS水平中的作用假设RTM衍生的Selenop可能潜在参与EMT调节。结果部分 4RTMs通过Selenop促进肿瘤细胞EMTSelenop功能验证为了研究RTM衍生的Selenop对肿瘤EMT的影响将Selenopfl/fl小鼠与Mrc1CreERT2小鼠杂交以条件性敲除Selenop基因在RTMs中。野生型WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠在原位肿瘤细胞注射前用他莫昔芬治疗。Selenop蛋白在CD206RTMs中显著减少但没有诱导绝对细胞数、增殖、凋亡或健康胰腺中已知促肿瘤分子的清除的显著变化Selenop蛋白水平在胰腺组织中显著降低但在血浆中相当支持在RTM中Selenop的整体旁分泌效应而非系统循环Selenop。Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠在肿瘤植入后具有更小的肿瘤尺寸和更好的生存与Selenopfl/flWT对照相比。重要的是来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞显示E-钙粘蛋白表达增加和EMT签名降低特别是在RTM富集的肿瘤边界区域但没有减少增殖。此外Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠显示显著降低的转移潜力与WT肿瘤相比。这些结果支持RTM衍生Selenop在促进肿瘤进展和肿瘤细胞EMT中的重要性。LRP8介导的摄取低密度脂蛋白受体相关蛋白8LRP8是一种可以介导细胞外Selenop摄取的受体。为了探究LRP8介导的Selenop摄取是否与RTM衍生Selenop模型一致生成Lrp8缺陷肿瘤细胞可以在体外正常增殖。WT小鼠注射Lrp8缺陷肿瘤细胞显示显著更小的肿瘤尺寸和降低的肿瘤EMT与对照组相比。进一步评估WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠中对照和Lrp8缺陷肿瘤细胞的肿瘤生长。来自其他三组的肿瘤显著小于来自WT小鼠的对照肿瘤。在Lrp8缺陷肿瘤组中WT和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠之间的肿瘤生长差异被消除。这些结果暗示LRP8可能介导RTM衍生Selenop向肿瘤细胞的转移并促进肿瘤EMT。体内硒转移为了检查Selenop转移是否在体内从RTMs转移到肿瘤细胞用74Se同位素在生理剂量下治疗对照、植入前RTM耗竭和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl荷瘤小鼠在肿瘤植入后28天。使用同位素作为示踪剂74Se水平在来自植入前RTM耗竭和Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞中显著降低与对照小鼠相比。在RTM富集的肿瘤边界也观察到74Se密度的显著下降支持肿瘤细胞中的硒含量由RTM衍生Selenop在体内调节的结论。共培养验证建立共培养系统使用肿瘤细胞和巨噬细胞。用Na274SeO3处理巨噬细胞并在充分洗涤后与肿瘤细胞共培养后肿瘤细胞中的74Se信号显著高于与肿瘤细胞共培养前的基线水平但与Selenop缺陷巨噬细胞共培养时降低。支持肿瘤细胞中巨噬细胞衍生Selenop的结论。与Lrp8-/-肿瘤细胞共培养时分离的Lrp8-/-肿瘤细胞中的74^Se信号较低。结果部分 5RTMs通过Selenop保护肿瘤细胞免于铁死亡铁死亡保护脂质ROS水平在来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤细胞中显著高于WT组。脂质过氧化标记物4-羟基壬烯醛4HNE水平在肿瘤边界显著增加。还测量了来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠肿瘤边界中4HNE肿瘤细胞与CD206巨噬细胞之间的距离减少与WT小鼠相比表明RTM衍生Selenop可能保护肿瘤细胞免于肿瘤边界处的铁死亡。铁死亡签名在来自Mrc1CreERT2Selenopfl/fl小鼠的肿瘤边界区域显著上调与WT小鼠相比表明在缺乏RTM衍生Selenop的情况下肿瘤边界处铁死亡增加。为了直接评估巨噬细胞衍生Selenop是否可以保护肿瘤细胞免于铁死亡将肿瘤细胞与Selenop充足或Selenop缺陷的腹腔巨噬细胞共培养并用铁死亡诱导剂RSL3处理。E-钙粘蛋白肿瘤细胞与Selenop充足巨噬细胞共培养显示显著降低的脂质过氧化与Selenop缺陷巨噬细胞相比。这些结果表明巨噬细胞衍生Selenop可以在体外直接拯救间充质肿瘤细胞免于铁死亡。增加的脂质过氧化也在植入前RTM耗竭组的肿瘤边界中观察到与对照组相比。铁死亡抑制剂liproxstatin-1治疗显著逆转了植入前RTM耗竭的抗肿瘤效果。在自发性胰腺肿瘤伴巨噬细胞耗竭中也观察到类似结果。总之这些发现表明RTMs通过在肿瘤边界提供外源性Selenop保护间充质肿瘤细胞免于铁死亡从而促进肿瘤EMT和向正常组织的侵袭性。结果部分 6RTM衍生SEPP1与人类患者中EMT介导的肿瘤进展相关人类PDAC验证基于在鼠PDAC中的发现研究人类RTM衍生SELENOP也称为SEPP1是否以类似方式影响患者肿瘤细胞EMT。在人类PDAC中观察到从相邻胰腺到肿瘤的空间硒水平和SEPP1密度显著降低。在肿瘤内SEPP1表达在E-钙粘蛋白lo区域高于E-钙粘蛋白hi区域。肿瘤细胞的4HNE MFI在肿瘤核心显著高于肿瘤边界。此外CD206表达在肿瘤边界显著高于匹配的肿瘤核心区域。肿瘤边界CD206表达较高的患者预后更差。这种模式也在公共PDAC数据库中观察到。这些观察表明鼠和人类PDAC中保守的RTM和SEPP1模式。人类RTM群体为了进一步研究人类PDAC中的RTM群体及其空间定位收集了额外的PDAC患者scRNA-seq数据识别出六个 distinct 单核细胞簇。与小鼠结果和其他人类PDAC数据集一致识别出FOLR2RTMs其高表达SLC40A1/SEPP1。使用Xenium多组织和癌症面板377个基因的空间转录组 profiling 进一步确认RTMs富集在肿瘤边界。scMetabolism和基因集变异分析GSVA揭示FOLR2RTMs表现出最高的硒化合物代谢活性和与硒结合和硒微量营养素网络相关的上调通路。由于SEPP1未包含在Xenium基因面板中使用基于测序的Stereo-seq获得全转录组数据验证FOLR2RTM标记基因包括FOLR2、SEPP1、CD209和SLC40A1在肿瘤边界共表达。这些发现表明FOLR2RTMs存在于人类PDAC的肿瘤边界并显示SEPP1的高表达水平以及增加的硒代谢活性。EMT与SEPP1相关性计算scRNA-seq数据中所有恶性细胞的EMT评分将其分为三组EMThi、EMTmed和EMTlo。与小鼠数据一致人类PDAC细胞中SEPP1表达与EMT和铁死亡通路活性负相关也在其他肿瘤类型中。代谢通量分析揭示硒酸盐和硒代蛋氨酸的摄取能力在间充质恶性细胞中显著降低。这意味着人类间充质PDAC细胞可能依赖外部SEPP1作为对抗铁死亡的拯救机制。使用稳健细胞类型分解RCTD估计Stereo-seq数据中每种细胞类型的比例发现FOLR2RTMs在空间上更接近EMThi细胞而非EMTmed和EMTlo PDAC细胞。总之数据表明在人类PDAC中RTMs可能通过在肿瘤边界提供SEPP1保护间充质肿瘤细胞免于铁死亡。讨论核心发现本研究定义了胰腺癌中RTMs的起源、异质性和功能。使用谱系追踪识别出健康和PDAC中保守的RTM签名并聚焦于植入前时间窗口此时RTMs在MDMs成为数量主导之前仍然突出。在这个窗口期RTM耗竭减缓PDAC进展支持在肿瘤侵袭和EMT相关进展中的作用而非在从良性到恶性疾病的遗传转变中。空间转录组学显示RTMs在肿瘤外周积累RTM衍生Selenop保护肿瘤细胞免于铁死亡并支持EMT。总之这些发现支持一个模型其中RTM衍生Selenop向间充质肿瘤细胞提供外源性硒限制铁死亡并促进侵袭。巨噬细胞功能起源 distinct 的巨噬细胞在肿瘤中发挥阶段和空间限制的功能。在肺和胰腺腺癌中RTMs贡献于肿瘤相关生态位而肺泡巨噬细胞促进EMT、调节性T细胞激活和组织重塑在非小细胞肺癌中。RTMs通常重新分布到肿瘤外周并在肿瘤核心逐渐被MDMs替代。跨癌症浸润的MDMs经常获得触发受体在髓系细胞上表达2TREM2程序也在慢性炎症和阿尔茨海默病中看到并且在PDAC中描述了空间 distinct 的MDM亚群。相比之下RTMs保留与组织发育和伤口修复相关的功能可能被肿瘤劫持以通过Selenop分泌支持EMT。EMT可以促进适应性肿瘤状态的出现数据揭示上皮Selenop表达与EMT活动之间的反向关系表明EMT相关程序可能抑制Selenop表达。RTM衍生Selenop也可能呼应发育程序因为RTMs和硒在胚胎发生中都是必需的。这种现象类似于非恶性细胞中的癌胎重编程其中胎儿样程序在TME中重新出现。研究发现表明胎儿样RTMs可能不仅塑造免疫抑制微环境还通过分泌必需分子直接支持肿瘤存活。因此肿瘤可能劫持发育和修复相关的巨噬细胞程序以创建营养支持生态位维持侵袭性癌症状态。EMT与铁死亡的联系EMT和铁死亡通过细胞可塑性、脂质重塑和氧化还原控制相联系。在EMT过程中E-钙粘蛋白丢失和EMT驱动因子如ZEB1可以激活YAP-ACSL4信号重塑磷脂并使膜富含易过氧化的脂质而GPX4中心的防御、胱氨酸代谢和脂质去饱和通路缓冲氧化应激。因此EMT促进侵袭和适应同时创造对铁死亡的条件性脆弱性其结果取决于脂质过氧化物解毒是否保持完整。研究识别出Selenop作为外部巨噬细胞衍生因子缓冲这种脆弱性。RTM衍生Selenop不是边界相关EMT的唯一驱动因素因为当Selenop减少时EMT特征持续存在并且可能由炎症线索、缺氧、细胞外基质重塑和肿瘤内在EMT程序维持。尽管如此靶向RTMs或Selenop可能在时间定义的TME背景下暴露EMThigh肿瘤细胞于铁死亡。总结研究识别出RTMs作为PDAC中的促肿瘤巨噬细胞谱系RTM衍生Selenop作为EMT相关铁死亡抵抗的关键介质。更广泛地说TME中的细胞外支持不仅由 bulk 营养可用性塑造还由细胞状态特异性依赖和生态位定义的免疫回路塑造。局限性模型限制原位模型发展迅速不是研究EMT全时间谱的理想模型。因此早期或初始指的是微环境定义的窗口而非癌前PDAC的最早遗传步骤。由于p53突变在PDAC患者中通常是晚期事件在没有Trp53扰动的自发性模型中的验证将很重要。Mrc1靶向的脱靶效应尽管Mrc1CreERT2RosaTdT没有标记胰腺内皮细胞但Mrc1驱动的靶向的胰腺外效应仍然是注意事项。膳食硒的作用RTM-Selenop轴中膳食硒的作用仍未解决。系统性硒耗竭难以测试因为硒具有狭窄的缺乏-毒性窗口长期耗竭可能引入系统性混杂因素。SEPP1的临床意义SEPP1的临床意义仍未解决因为肿瘤边界SEPP1可能反映混合细胞来源和具有非等价生物效应的不同亚型尽管SEPP1表达在多种肿瘤类型中与EMT负相关。其他硒蛋白的冗余尽管其他硒蛋白在转录水平上没有稳健诱导但不能排除蛋白质或活性水平的冗余。未来研究将需要更严格地控制系统性硒状态和更高的空间、亚型特异性和功能分辨率。方法小鼠小鼠在SPF条件下饲养于上海交通大学医学院动物设施。所有涉及动物的程序由上海交通大学医学院机构动物护理和使用委员会IACUC审查和批准。除非另有说明体内实验使用年龄和性别匹配的C57BL/6背景小鼠。Ms4a3Cre和Ms4a3CreERT2小鼠由研究团队生成并先前描述。Mrc1CreERT2小鼠在上海模式生物中心生成。Selenopflox小鼠从Cyagen购买。Selenopflox小鼠和Lyz2Cre小鼠杂交生成Lyz2CreSelenopflox小鼠。细胞系鼠源KPC1199细胞系源自自发性PDAC小鼠模型KPCLSL-KrasG12D/; Trp53R172H/, Pdx1Cre在C57BL/6遗传背景。荧光素酶稳定的胰腺导管腺癌FC1242L细胞系源自LSL-KrasG12D; LSL-Trp53/R172H; Pdx1CreKPC小鼠。FC1242L细胞系用于原位肿瘤注射。KPC1199细胞系用于体外细胞共培养。人类临床样本获取人类PDAC标本和相关临床数据从上海交通大学医学院瑞金医院获得经瑞金医院伦理委员会批准。敲除细胞系生成对于CRISPR-Cas9敲除细胞系合成靶向小鼠Zeb1、小鼠Selenop和小鼠Lrp8的sgRNAs并克隆到GV708载体中。构建体用Lipofectamine 3000引入肿瘤细胞成功转染的细胞通过嘌呤霉素选择富集。通过有限稀释获得克隆系。通过Sanger测序和流式细胞术评估蛋白质表达验证基因破坏。小鼠治疗和RTM耗竭对于谱系标记Mrc1CreERT2RosaTdT小鼠通过口服灌胃接受他莫昔芬连续四天每剂含1.75 mg在100 μL中最终剂量在肿瘤注射前三天。为了耗竭RTMsMrc1CreERT2RosaDTR小鼠如上接受他莫昔芬然后在肿瘤注射前两天或后10天通过腹腔注射接受500 ng白喉毒素在200 μL PBS中。Liproxstatin-1通过腹腔注射以10 mg/kg给药从肿瘤植入后第10天开始每周两次直至收获。对于KPC小鼠中的RTM耗竭6周龄动物在第1天静脉接受1 mg抗小鼠CSF1抗体随后在第2天腹腔接受200 μL氯膦酸盐脂质体。肿瘤细胞原位注射对于原位植入2.5×105肿瘤细胞制备在50 μL含30% Matrigel的冰冷PBS中在麻醉下注射到胰腺。体内生物发光发射成像荧光素酶稳定肿瘤细胞植入以进行肿瘤生长的纵向监测。在注射后第7、14、21和28天小鼠用异氟烷麻醉并在腹腔注射D-荧光素150 mg/kg8分钟后使用IVIS Spectrum系统成像。细胞分离胰腺切成小块并用0.2 mg/mL IV型胶原酶和0.05 mg/mL DNase I在含10% FBS的RPMI 1640中37°C消化30分钟。消化后组织悬液通过反复通过1.2 mm内径针头机械分散。匀浆细胞通过70 μm孔径细胞筛过滤并用MACS缓冲液洗涤两次。红细胞在ACK缓冲液中裂解三分钟。流式细胞术和细胞分选从胰腺或肿瘤组织生成的单细胞悬液进行流式细胞术染色和分析。样品在Cytek Aurora光谱流式细胞仪上运行所得FCS文件在FlowJo中分析。荧光标记群体在BD FACSAria III上纯化DAPI用于排除非活力细胞。免疫荧光和分析新鲜收集的组织在1%多聚甲醛PFA中浸泡过夜固定随后在30%蔗糖中冷冻保护。样品嵌入OCT化合物并使用Leica冷冻切片机切片为20 μm。荧光图像使用SLIDEVIEW VS200载玻片扫描仪或FLUOVIEW FV3000共聚焦显微镜获取。多重免疫组化mIHC组织收获并在4% PFA中固定过夜梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋。mIHC测定在5 μm厚切片上使用Tyramide Signal AmplificationTSA七色试剂盒按照制造商说明进行。图像使用SLIDEVIEW VS200捕获使用QuPathv.0.6.0分析。循环多重TSACmTSA组织收获并在4% PFA中固定过夜梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋。FFPE组织样品切成5 μm厚切片并在二甲苯中脱蜡通过梯度乙醇再水化并使用柠檬酸盐缓冲液pH 6.0在95°C下热诱导抗原修复30分钟。抗体标记使用IRISKit HyperView mTSA Kit进行。图像配准使用Fiji实现。mIHC分析mIHC图像的数字化定量使用QuPath进行。原始数据预处理用于背景减除和通道对齐。细胞分割使用QuPath-Cellpose扩展执行利用cpsamCellpose-SAM预训练模型基于DAPI核和膜/细胞质标记物稳健识别细胞边界。细胞通过基于个体标记物强度阈值的分层布尔逻辑进行表型分型。对于空间表征手动注释肿瘤边界以定义两个200 μm小鼠或500 μm人类区域肿瘤内和肿瘤周围。IHC定量H-score对于人类PDAC IHC染色全切片图像使用QuPath分析。组织区域基于形态学特征分类为肿瘤和相邻胰腺。H-score使用内置阳性细胞检测命令计算。细胞间距离定量为了量化4HNE和CD206细胞之间的空间关联首先从数字化图像中提取其质心坐标。对于每个4HNE细胞通过使用K-最近邻KNN算法k1计算欧几里得距离确定其最近CD206邻居的邻近性。体外细胞共培养1×105胰腺肿瘤细胞和4×104来自Lyz2CreSelenopfl/fl或野生型小鼠的腹腔巨噬细胞在48孔板中共培养3天在含5 nM RSL3的培养基中。用BODIPY 581/591 C11染色后通过流式细胞术检测肿瘤细胞的脂质ROS水平。Na274SeO3合成1.6 mg 74Se粉末溶解在20 μL 70% HNO3中加入180 μL去离子水制成108.2 mmol/L H274SeO3溶液。使用10 M NaOH溶液将pH调节至10.5通过加入去离子水将体积增加至800 μL使74Se浓度为27.1 mmol/L。储备液储存在4°C。体外74Se转移测定小鼠腹腔注射450 μg/kg Na274SeO3。三天后收集腹腔巨噬细胞彻底洗涤以5×105细胞/孔接种在6孔板中然后与肿瘤细胞共培养36小时。CD45CD11bF4/80巨噬细胞和CD45-肿瘤细胞通过FACS分选通过电感耦合等离子体质谱ICP-MS测量74Se含量。体内74Se转移测定在原位肿瘤植入后第28天小鼠接受单次腹腔注射90 μg/kg Na274SeO3。三天后通过FACS分选肿瘤细胞并通过ICP-MS测量74Se含量。电感耦合等离子体质谱通过FACS分离细胞群体彻底洗涤细胞然后用100 μL双蒸水裂解。将100 μL细胞裂解物的准确体积转移到反应离心管中加入100 μL硝酸68%。混合物在水浴中100°C加热一小时然后冷却并用双蒸水稀释至最终体积1 mL。使用PerkinElmer ICP-MS测量细胞中74Se浓度。激光烧蚀电感耦合等离子体质谱LA-ICP-MS小鼠和人类肿瘤组织石蜡包埋切成10 μm厚切片脱蜡。使用GenesisBIO飞秒激光烧蚀系统和四极杆ICP-MS仪器分析每个组织切片感兴趣区域ROIs中硒Se的分布。小鼠中74Se硒分布和人类肿瘤切片中80硒分布通过LA-ICP-MS分析。测量元素强度谱转换为2D图并使用Iolite V4进一步处理。单细胞RNA测序肿瘤组织在含10% FBS的RPMI-1640中切成1-2 mm3小块。这些小块使用肿瘤解离试剂盒在gentleMACS Octo Dissociator中37°C消化一小时严格按照制造商说明。解离细胞通过70 μm孔径SmartStrainer过滤并在冰上用红细胞裂解溶液处理5-10分钟以去除红细胞。细胞用PBS洗涤两次并以300×g离心五分钟。临床PDAC样品的空间转录组学Xenium In Situ空间转录组 profiling为了评估FFPE块内的组织质量进行HE和DAPI染色。组织样品还通过测量DV200确定RNA完整性。FFPE切片使用制造商推荐的FFPE方案处理用于Xenium In Situ分析。Stereo-seq样品制备和处理新鲜组织在切除后30分钟内用无菌无纺布干燥并嵌入OCT。冷冻切片使用LEICA CM1950冷冻切片机在-20°C切成10 μm厚度。数据分析Bulk RNA-seq数据分析Bulk RNA-seq数据在TPM水平定量随后使用preprocessCore R包进行分位数归一化。使用ComBat校正不同组织之间的批次效应。scRNA-seq数据分析来自Ms4a3CreERT2RosaTdT的scRNA-seq数据首先按组织来源分层随后与来自可诱导自发性KC小鼠的scRNA-seq数据进行典型相关分析-based整合。聚类使用top 15主成分PCs和0.6的分辨率进行。基因集富集分析使用LIMMA包计算基因表达差异调整P值0.05的基因定义为DEGs。GO通路富集在R中使用clusterProfiler的gseGO函数进行。基因集变异分析使用GSVA包实现。差异丰度分析使用观察与预期细胞数比率Ro/e测试治疗组之间细胞丰度差异。代谢分析scMetabolism用于在单细胞分辨率量化小鼠和人类巨噬细胞的代谢活动。使用METAFlux计算人类PDAC TME中硒酸盐和硒代蛋氨酸的通量。空间转录组学数据分析10x Visium数据使用Seurat R包分析使用SCTransform进行数据归一化和特征选择。Xenium数据使用LoadXenium加载后过滤少于15个计数和十个基因的细胞。Stereo-seq分析中表达矩阵分箱为非重叠100×100或10×10 DNB窗口。生存分析PDAC患者的总生存OS分析使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行。统计统计分析使用GraphPad Prism 10进行除非另有说明。数据表示为平均值±SD除非另有说明。对于两组比较正态分布数据集使用双尾非配对Students t检验分析而非参数数据集使用Mann-Whitney U检验评估。配对数据使用配对t检验分析。分类变量使用Fisher精确检验分析。生存曲线使用Kaplan-Meier方法生成并通过log-rank检验比较。统计显著性定义为p0.05p0.01**p0.001****p0.0001ns不显著p0.05。关键结论RTMs在肿瘤边界富集RTMs优先定位于PDAC肿瘤边界在那里它们促进EMT、肿瘤生长和转移。Selenop作为关键介质RTMs通过LRP8依赖性摄取将硒转运蛋白Selenop转移给EMT肿瘤细胞增加肿瘤细胞硒可用性限制脂质过氧化并保护EMT肿瘤细胞免于铁死亡。遗传验证RTM特异性Selenop缺失或肿瘤细胞Lrp8破坏减少了EMT和肿瘤进展而铁死亡抑制逆转了RTM耗竭的效果。人类PDAC保守性人类PDAC显示边界富集的SEPP1⁺RTMsFOLR2⁺靠近EMT肿瘤细胞提示一种保守的巨噬细胞来源的硒生态位支持侵袭性肿瘤状态。治疗意义靶向RTMs或其分泌因子如Selenop可能代表PDAC治疗的新策略通过暴露EMThigh肿瘤细胞于铁死亡。概念性贡献TME中的细胞外支持不仅由 bulk 营养可用性塑造还由细胞状态特异性依赖和生态位定义的免疫回路塑造。肿瘤可能劫持发育和修复相关的巨噬细胞程序以创建营养支持生态位维持侵袭性癌症状态。生活很好有你更好。